W 1570 roku w Wilnie zastało założone Kolegium Jezuickie. Wówczas na Litwie rozpowszechnił się ruch reformacyjny i do walki z reformacją sprowadzeni zostali jezuici.
Król Stefan Batory przeznaczył środki na przekształcenie Kolegium Jezuickiego w Akademię. W 1579 roku zalożenie wyższej uczelni oficjalnie zaaprobował papież Grzegorz XIII.
Oficjalnym językiem wykładowym na uczelni była łacina. Pierwszym rektorem był P. Skarga, a do grona profesorskiego należeli m.in: J. Wujek, M. K. Sarbiewski, M. Śmiglecki. W 1595 r. Mikołaj Dauksza przetłumaczył z jęz. polskiego na jez. litewski i wydał w drukarni akademickiej „Katechizm“ hiszpańskiego jezuity Jakuba Ledesmy. Jest to pierwsza litewska książka wydrukowana na terenie etnicznej Litwy.
W XVII wieku uczelnia miała już swoich wykładowców dobrze znających język litewski. Wśród nich Konstanty Szyrwid (wykładowca języka litewskiego, kierownik katedry języka litewskiego założonej w 1620 roku), który wydał słownik łacińsko-polsko-litewski, gramatykę języka litewskiego oraz zbiór kazań w języku litewskim. W 1669 r. Wojciech Wijuk-Kojałowicz, ówczesny rektor uniwersytetu, wydał pierwszą dwutomową historię Litwy. Wileńska Alma Mater różniła się w tym czasie od innych uniwersytetów europejskich tylko tym, że zamiast 4 typowych dla średniowiecznych wyższych szkół wydziałów istniały tylko dwa (filozofia oraz teologia, nie było prawa i medycyny).
Po kasacie zakonu jezuitów w 1773 opiekę nad uczelnią przejęła Komisja Edukacji Narodowej, która przemianowała dotychczasową Akademię Wileńską na Szkołę Główną Wielkiego Księstwa Litewskiego. Po ostatnim rozbiorze (1795 r.) uczelnię przemianowano na Szkołę Główną Wileńską, w 1803 r. na Cesarski Uniwersytet Wileński. Do grona wychowanków Uniwersytetu należeli poeci: A. Mickiewicz, J. Słowacki, pisarz J.I. Kraszewski, uczeni: J. Jeżowski, M. Malinowski, J.F. Wolfgang. Na czele grona profesorów stali: matematyk Jan Śniadecki (twórca „Filozofii umysłu ludzkiego“ z 1821 r.), chemik Jędrzej Śniadecki (autor pierwszego polskiego podręcznika chemii z 1800 roku), malarz obrazów o tematyce historycznej Franciszek Smuglewicz, malarz Jan Rustem, teoretyk literatury Euzebiusz Słowacki (ojciec Juliusza Słowackiego), lekarz August Becu (ojczym Juliusza Słowackiego), architekt Michał Szulc. Na początku XIX wieku uniwersytet był jedną z czołowych europejskich uczelni.
Z historią Cesarskiego Uniwersytetu związany jest ruch filomacki, którego efektem były aresztowania studentów i proces filomacki w roku 1824. Po tym zaczął się powolny upadek uczelni. W 1832 r. władze carskie zamknęły uczelnię za szerzenie wolnomyślicielstwa, a majątek przekazano Uniwersytetowi Kijowskiemu.
W okresie II Rzeczypospolitej w latach 1919–1939 Uniwersytet Stefana Batorego był trzecim najstarszym uniwersytetem na ziemiach Rzeczypospolitej Obojga Narodów i jeden z najstarszych uniwersytetów w Europie Wschodniej i Północnej.
Teren Uniwersytetu Wileńskiego kształtował się w ciągu kilku stuleci, dlatego są tu zarówno budynki gotyckie i renesansowe, jak też barokowe i klasycystyczne. Swoistego kolorytu nadają uczelni arkady i galerie oraz trzynaście wewnętrznych dziedzińców. Dziedzińce nazwane są imionami wybitnych wychowanków i profesorów tej uczelni. Na Dziedzińcu Wielkim na ich cześć osłonięte zostały tablice pamiątkowe. Od strony architektonicznej budynki uczelni prezentują się niezwykle okazale. Najbardziej popularnymi i najczęściej ukazywanymi na zdjęciach miejscami, są Dziedziniec Wielki i kościół św. Jana Chrzciciela i Jana Ewangelisty.
Obecnie na uniwersytecie jest 12 wydziałów, na których studiuje 23 tysiące osób. W historycznych gmachach uczelni swoją siedzibę ma administracja uniwersytetu, mieszczą się też trzy wydziały: historii, filologii i filozofii. Działa tu również biblioteka. Jej zbiory liczą ponad 5 milionów ksiąg drukowanych i starych rękopisów. Wśród nich jeden z dwóch na świecie oryginalnych egzemplarzy pierwszej litewskiej książki – Katechizmu Martynasa Mažvydasa.